侯莉娟 郝银丽 王拥军
【摘要】目的:观察大鼠压迫损伤后腰神经根组织BDNF和NT-3的含量;探讨损伤后不同阶段神经根组织神经营养因子的表达,及药物腰痛宁和弥可保对其表达的影响。方法:采用置入微型硅胶片法,建立大鼠腰神经根压迫性损伤模型,用酶联免疫吸附试验(ELISA法),测定损伤后30、60天神经根组织中BDNF和NT-3含量,观察腰痛宁及弥可保等药物干预对其表达变化的影响。结果:正常时,腰神经根组织中BDNF和NT-3有一定量的表达。损伤30天时明显升高(P<0.01)。60天下降接近正常组。损伤30天,腰痛宁组BDNF、弥可保组BDNF、NT-3的表达明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。损伤60天,腰痛宁组BDNF、NT-3及弥可保组BDNF的表达均高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腰神经根压迫损伤30天时,损伤神经根组织BDNF、NT-3的表达自身保护性、反应性升高,可能与促进损伤神经再生修复有关。腰痛宁、弥可保均可影响和调控损伤30、60天不同阶段神经根组织BDNF、NT-3的表达,参与损伤神经再生修复过程。
【关键词】腰神经根压迫;损伤神经根组织;BDNF、NT-3;腰痛宁;弥可保
【Abstract】Objectives:To observe the effect of Yaotongning (YTN) and Methycobal on BDNF and NT-3 in nerve root compression injury rats.Methods:The nerve root compression injury models were established by inserting mini silicon film to nerve root. ELISA was applied to evaluate the change of BDNF and NT-3 in nerve root tissue at the 30th and 60th day. Results:The BDNF and NT-3 content in lumbar nerve root significantly increased after at the 30th day (P<0.01), and recovered to the normal level at the 60th day. BDNF content inYTN and Methycobal groups and NT-3 in YTN group were markedly lower than those in model group at the 30th day (P<0.01). And BDNF and NT-3 content of YTN group and NT-3 content in Methycobal group were statistically higher than model group at the 60th day.Conclusion:The increased expression of BDNF and NT-3 in nerve tissue at the 30th day when injury might result in damaged nerve tissue regeneration. YTN and Methycobal can modulate the expression of BDNF and NT-3, which participate in the damaged nerve tissue regeneration process.
【Key words】 Lumbar nerve root; Compression injury, BDNF; NT-3; Yaotongning; Methycobal
因脊柱退行性病变,椎间盘突出、韧带肥厚、骨赘形成等因素所引起的神经根压迫损伤的发病逐年增多。神经根损伤后,保护损伤的神经元,减少或阻止神经元变性和死亡,促进神经纤维修复和再生,最大限度地恢复神经功能是研究的主要方向。本实验拟通过观察大鼠压迫损伤后腰神经根组织中脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factors,BDNF)和神经营养因子-3 (neurotrophin-3, NT-3)含量的变化,以及腰痛宁和弥可保对其表达的影响,以期从神经营养因子环节探讨中医药治疗神经损伤修复的机制,为临床治疗提供一定的理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
3月龄雄性SD大鼠70只,体重290±20g ,购自上海市西普尔-必凯实验动物有限公司。适应性饲养2天后随机分为7组,即正常组,30天和60天模型组, 30天和60天腰痛宁组,30天和60天弥可保组,每组10只。
1.2 药物
腰痛宁胶囊,河北承德颈复康药业集团有限公司生产,0.3g/粒,国药准字Z13020898;弥可保片,卫材(中国)药业有限公司生产,500μg/片,国药准字:H20030812。
1.3 试剂与仪器
BDNF和NT-3 ELISA Kit (美国普洛麦格生物技术有限公司), HangPing FA1004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司),新芝DY-89-1型电动玻璃均浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司),5417R型冷冻离心机(德国Germany公司),ZD-9556水平摇床(江苏太仓科教器材生产厂), Multiskan MK3酶标仪(芬兰Labsystem公司)。
1.4 模型制备与取材
采用本研究所1999年建立的腰神经根压迫造模方法[1]。大鼠经氯胺酮0.10~0.12g/ kg腹腔注射麻醉后,以L4、L5椎体间隙为中心,后背正中切开长度约4cm ,逐层切开后暴露椎板,去除L4、5棘突、椎板及右侧关节突,充分暴露马尾神经及右侧L5神经根,将30±1.5mg的硅胶片置于L5神经根与硬膜囊交界处的腋部,局部固定,逐层缝合。术后第2天,腰痛宁组、弥可保组分别按人与动物体表换算关系[2]确定,相当于临床等效剂量,给予各药灌胃,每天灌胃1次。正常组、模型组造模后常规饲养,不作任何处理。于术后30天,正常组、模型组、腰痛宁组、弥可保组分别按人与动物体表换算关系[2]确定,相当于临床等效剂量,给予各药灌胃,每天灌胃1次。正常组、模型组造模后常规饲养,不作任何处理。于术后30天,正常组、模型组、腰痛宁组、弥可保组和60天模型组、腰痛宁组、弥可保组的大鼠,经氯胺酮腹腔注射麻醉后,暴露右侧L5神经根出硬膜囊处硅胶片压迫区,快速取出神经根组织放进液氮中,后转入-80℃冰箱中保存。
1.5 观察项目测定
①神经根组织总蛋白的抽提从-80℃冰箱中迅速取出神经根组织,快速称重,放入预冷的冰生理盐水中,按10%比例在冰冻下电动玻璃均浆机匀浆,4℃离心3500rpm、15min,取上清液于离心管中,置于-20℃冰箱保存待测。②BDNF及NGF含量检测ELISA法测定,严格按试剂盒说明书操作。
1.6 数据处理
用SPSS 13.0统计软件包分析数据,采用方差分析两两均数比较的LSD法,对各组之间的差异进行检验。数据以 ±s表示。
2 结果
2.1 30天组别腰神经根组织BDNF、NT-3含量的变化(见表1)
2.2 60天组别腰神经根组织BDNF、NT-3含量的变化(见表2)
3 讨论
神经根损伤后神经再生修复是当今研究领域内的热点。广泛分布于靶细胞、神经元及邻近胶质细胞的神经生长因子家族(nerve growth factors , NGFs),在神经系统发育和正常生理功能维持及神经损伤中起着重要的作用。目前研究较清楚的是神经生长因子、脑源性神经营养因子,神经营养素-3。NGF广泛存在于动物体内,是神经系统中重要的生物活性因子之一,主要是通过抑制神经细胞凋亡来影响神经细胞的发育、生存[3]。而与NGF在蛋白序列方面有高度的同源性的BDNF,则是维持和保护神经元(尤其是运动神经元)存活和生长的最有效的生物活性物质[4],其由外周靶细胞分泌后,主要分布于中枢神经系统,以自分泌和旁分泌的形式参与神经元的发育、分化、正常存活,可促进受损神经元的存活与再生,还可预防或改善某些神经元的病理过程[5~7]。与NGF相比,NT-3的特点是其作用范围的广泛性,NT-3对交感神经元、神经嵴和基板来源感觉神经元、脊髓运动神经元、前庭和螺旋神经节神经元、视神经节神经元、基底前脑胆碱能神经元、纹状体多胺能和GABA能神经元、蓝斑肾上腺素能神经元、海马、皮层和小脑神经元等,多种不同发育阶段的中枢和外周神经元具有促存活和分化功能[8,9]。
所以,本文重点研究了大鼠腰神经根压迫损伤后BDNF和NT-3含量的变化以及腰痛宁、弥可保对其表达的影响,初步探讨了神经根压迫损伤后神经营养因子的生物学作用及药物干预对促进损伤神经再生修复的机制。
3.1 神经根损伤后BDNF、NT3含量变化及意义
大量的研究已提示BDNF和NT-3对促进神经元损伤的修复、再生等亦有十分重要的作用[10~13]。倪师今等[14]研究发现外周支和中枢支切断后,背根节内BDNF和NT-3的阳性细胞数均较正常者有不同程度升高,表明损伤后可致背根节神经元BDNF和NT-3表达增加,而这些变化可能有利于损伤神经元的修复。其它文献亦报道,坐骨神经切断后10天,神经远端BDNF及trKC mRNA的表达亦明显升高,其增高水平为NGF mRNA的10倍,其时空表达模式也与NGF mRNA有所不同。在神经损伤后3天BDNF mRNA开始缓慢增加,至3~4周达到最高峰[15,16]。所以BDNF表达上调可抵御神经元损伤,即对其有保护作用[17]。本研究结果发现正常组神经根组织中BDNF、NT-3的表达较低,在压迫损伤30天表达明显升高,这与上述文献报道大致相似。说明损伤的神经根组织具有自我保护的能力,BDNF、NT-3作为有营养和神经保护作用的关键因子,当面对损伤等应激状态时,具有自身调节保护作用,存在自我调控的能力,通过其高表达,促进损伤神经元的修复。在损伤60天神经根组织中BDNF、NT-3的表达下降,说明其表达具有时效性。
3.2 腰痛宁及弥可保对损伤腰神经根BDNF、NT-3表达变化的影响
我们研究表明,损伤30天组别中腰痛宁组NT-3与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。但腰痛宁组BDNF、弥可保组BDNF、NT-3的表达低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01),可能药物干预后,30天损伤神经根组织应激性表达升高的自身调节保护作用不再是主要的环节,因此表达下降。损伤60天组别,腰痛宁组BDNF、NT-3、弥可保组BDNF仍维持高表达,与模型组差异有统计学意义(P<0.05),弥可保组NT-3表达虽有一定升高,但与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。说明腰痛宁、弥可保等药物干预后,可能通过影响和调控损伤30、60天不同阶段的神经根组织BDNF、NT-3的表达,参与损伤神经再生修复。
西药弥可保是临床常用的药物,国内外一些实验和临床研究已表明:由于该甲基的存在,参与了生物转甲基的作用,并参与核酸、蛋白质的合成,能很好地转移进入神经细胞组织的细胞器,对损伤后的周围神经有促进其恢复的作用,疗效较好,但制剂工艺复杂,价格昂贵,临床常规用药困难较大。中医药具有多靶点、多方位、多途径治疗作用及效卓价廉的独特优势,现已成为研究的热点之一。大量实验显示中药具有促进周围神经损伤后神经营养因子的表达,保护受损神经元和促进神经修复的作用。中药腰痛宁胶囊的主要成分有马钱子、僵蚕、乳香、没药、麻黄、苍术、甘草等中药,其中以马钱子通络散结,消肿止痛为君;配以僵蚕熄风通络,乳香、没药活血化瘀、通经舒络为臣;苍术、麻黄温经通络以除湿邪为佐;甘草调和诸药并制马钱子之烈性为使。全方具有化瘀通络、消肿止痛的作用。因此,腰痛宁可能充分发挥了扩张神经外周及机体全身组织内部血管作用,改善损伤神经组织微循环,提高微动脉的血流量,增加对神经再生物质的供给,促进具有双向性的轴浆流恢复,使损伤神经根组织BDNF、NT-3在损伤60天仍维持高表达,促进损伤神经的修复。
本研究探讨了腰神经根损伤组织中BDNF、NT-3表达变化,揭示了腰神经根压迫损伤后神经损伤再生修复的机理。发现中药腰痛宁可影响和调控损伤神经根组织BDNF、NT-3的表达,促进神经的修复,有类似于西药弥可保的作用。为不断阐述中医药治疗腰神经根压迫损伤的作用机制提供了实验依据,亦体现了中医在临床应用中的特色及优势。
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（本文原载于《中国中医骨伤科杂志》2008年9月第16卷第9期第23-25页）
